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教你如何选择融合蛋白接头Linker

  • 发布时间:2021-09-07
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融合蛋白于分子生物学中的应用极为广泛最简单的应用是于蛋白质的末端连上标签用于WB检测或纯化.复杂1些的应用则是将需要研究的目的蛋白与另1个标记蛋白连接:当标记蛋白为荧光蛋白时可将目的蛋白的示踪和图像学分析;标记蛋白为白蛋白或者抗体Fc片段时可用于延长目的蛋白的半衰期;又或者将两个目的蛋白连接用于研究他们的共同功能或者相互作用.

作为需要使用融合蛋白的科研工作者了解1些必要的Linker知识将使得您于设计质粒方面更加得心应手.本文将介绍1下天然形式下的蛋白Linker和目前应用最广泛的人工合成Linker以8们的特性;其次介绍通过增加蛋白Linker实现的各种功能包括提高折叠和稳定性促进蛋白质表达增加内于生物学活性;最后介绍如何使用于线工具设计Linker.

本站通常将使用的蛋白Linker分为3种分别为柔性Linker .刚性Linker以及可剪切(或自剪切)Linker.

  

柔性Linker

最常见的柔性Linker就是GGly)甘氨酸和SSer)丝氨酸的GS组合最常用的GS组合就是(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n通过改变n的大.研究者可以将结构域之间的距离放大和减.实现结构域分离(n2)或连接结构域研究其相互作用.

其他1些常见的蛋白Linker具有1些特定的用途例如单链可变片段(single chain variable fragment (scFv))中连接重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的柔性Linker通常为KESGSVSSEQLAQFRSLD EGKSSGSGSESKST.这些序列中甘氨酸(Gly)和丝氨酸(Ser)提供柔软度谷氨酸(Glu)和赖氨酸(Lys)提高水溶性.

更简单粗暴1些的柔性Linker就是纯甘氨酸(Gly)组成的(Gly)8或短1点点的(Gly)6它们的优点是于酵母表达纯化过程中能够抵抗蛋白酶的水解同时保护两端蛋白结构域的功能活性.

 

刚性Linker

具有(EAAAK)n序列的α-螺旋形成的Linker具有内部氢键和密切联系肽链骨干刚性且稳定.因此刚性α-螺旋Linker可作为蛋白质结构域之间的刚性间隔.通过将蓝色荧光蛋白(EBFP)和绿色荧光蛋白(EGFP)连接于1起评估荧光共振能量转移(FRET)之间的效率可以发现(EAAAK)n序列连接两个荧光蛋白时荧光共振能量转移效率比(GGGGS)n序列低说明α-螺旋Linker能够有效的隔离两个不同的蛋白结构域.

另1种类型的刚性Linker具有Pro-rich序列(XP)n其中X可指定任何氨基酸推荐选择丙氨酸(Ala)赖氨酸(Lys)或谷氨酸(Glu).(XP)n序列没有螺旋结构Linker中存于的脯氨酸(Pro)可以增加骨架硬度并且有效分离结构域.富含脯氨酸序列的结构于机体中广泛的存于例如骨骼肌蛋白的N端就存于(Ala-Pro)7的结构.

刚性Linker表现出相对坚硬的结构能够有效的将两端的蛋白结构域分开通过改变n的大.就能够轻易调整结构域之间的最佳距离从而保证两端蛋白的活性与生物功能.

 

可剪切Linker

到目前为止讨论的Linker通常不会于体内裂解.这些稳定的接头共价连接两个功能域使得融合蛋白于体内变成1个蛋白.功能结构域之间的稳定连接提供许多优点例如延长的血浆半衰期(例如白蛋白或Fc融合).然而它也有1些潜于的缺点包括功能域之间的空间位阻生物活性降低以及由于域之间的干扰导致蛋白质部分的生物分布和代谢方式改变.于这些情况下引入可剪切Linker使得融合蛋白能够于体内释放分离两个功能结构域.

1个研究的比较透彻的过程是2硫键的还原.这个可剪切Linker序列为LEAGCKNFFPRSFTSCGSLE基于2硫环肽于接头上的两个半胱氨酸(Cys)残基之间形成的分子内2硫键同时这个序列对凝血酶敏感.于凝血酶的作用下能够有效的对Linker中凝血酶敏感序列(PRS)进行切割.

其他比较流行的可剪切Linker能够不依赖蛋白酶自行进行切割处理使得两个结构域断裂.这些自剪切Linker通为2A短肽通常于序列NPGP进行自剪切分离.2A短肽通常来源于瞏镜牡鞍字市蛄欣如P2A表示来源于猪捷申瞏荆porcine teschovirus-1);E2A表示来源于马鼻炎瞏荆equine rhinitis A virus);F2A表示来源于口蹄疫瞏荆Footand Mouth Disease Virus).由于自剪切效率各有不同2A短肽之间也存于1定差异本站1般推荐使用P2AT2A序列.

如何设计Linker

随着对天然多结构域蛋白中的Linker和重组融合蛋白的广泛研究研究者们萌生了构建数据库的想法提出了Linker设计工具基于融合蛋白的期望特性来合理设计Linker.这种类型的工具的1个典型例子是名为synlinker的程序该程序于用户指定的输入(例如Linker长度要避免的蛋白酶敏感序列)中搜索其连接子序列的数据库并生成几个连接子序列的输出.Linker数据库是基于这样的假设建立的即于X射线晶体结构或NMR溶液结构中观察到的环序列可能采用延伸构象作为融合蛋白中的Linker.最终的数据库包含14,734个序列它们包含PDB文件中的记录可自动识别蛋白质的2级和环状结构.程序的基本输入是Linker序列的期望长度通常表示为残基数量或以埃为单位的距离.额外的输入参数包括避免被蛋白酶或限制性内切酶切割使得选择的Linker于克隆过程中对特定蛋白酶稳定或序列对限制性内切酶具有抗性.使用者还可以加入氨基酸组成偏好(例如消除疏水性残基)以进1步选择其感兴趣的Linker.此程序可以作为生成Linker序列的工具使用10分便利(http://synlinker.syncti.org/).

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参考文献

[1] Fusion proteinlinkers: property, design and functionality. Adv Drug Deliv Rev. 2013 Oct;65(10):1357-69. doi: 10.1016/j.addr.2012.09.039. Epub 2012 Sep 29.

[2] Effect oflinker flexibility and length on the functionality of a cytotoxic engineeredantibody fragment. J. Biotechnol. 2015. 199: 90-97.

[3] High cleavageefficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human celllines, zebrafish and mice. PLoS One. 2011; 6(4):e18556. doi:10.1371/journal.pone.0018556. Epub 2011 Apr 29.

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